En test permettant de déterminer la capacité d'une bactérie à hydrolyser le tryptophane, un acide aminé (avec figure)

Dans Dole Test, découvrez la capacité d’une bactérie à hydrolyser le tryptophane, un acide aminé!

Principe:

Certaines bactéries ont la capacité d'hydrolyser le tryptophane, un acide aminé, en indole, car elles peuvent produire l'enzyme «tryptophanase».

Le tryptophane est hydrolysé par la production d'indole, d'acide pyruvique et d'ammoniac. L'indole est détecté par le réactif coloré, le paradiméthylaminobenzaldéhyde (p-DMAB, le réactif de Kovac), qui produit un anneau rose. L'indole réagit avec le p-DMAB pour produire le composé "composé rouge vif rouge vif (colorant rosindole)", de couleur rose. L'anneau est produit à la surface, le réactif étant préparé dans de l'alcool amylique.

Dans le test à l'indole, les bactéries à tester sont cultivées dans un bouillon contenant du tryptophane. Si la bactérie a la capacité d'hydrolyser le tryptophane en indole, un anneau rose se forme à la surface de la culture en bouillon lors de l'ajout de p-DMAB.

Matériaux nécessaires:

Tubes à essai, fiole conique, tampons en coton, boucle d'inoculation, autoclave, brûleur Bunsen, chambre à flux laminaire, bocal, incubateur, bouillon de tryptone, réactif de Kovac (paradiméthylaminobenzaldéhyde), colonies isolées ou cultures pures de bactéries.

Procédure:

1. Les ingrédients du bouillon tryptone ou de sa poudre prête à l'emploi requis pour 100 ml de bouillon sont pesés et dissous dans 100 ml d'eau distillée dans une fiole conique de 250 ml par agitation et tourbillonnement. La tryptone agit comme une source de tryptophane. Par conséquent, l'ajout de tryptophane au bouillon est facultatif (figure 7.3).

2. Son pH est déterminé à l'aide d'un papier pH ou d'un pH-mètre et ajusté à 7, 5 à l'aide de HCl 0, 1 N s'il est supérieur ou de NaOH 0, 1 N s'il est inférieur. Le ballon est chauffé, si nécessaire, pour dissoudre complètement les ingrédients.

3. Le bouillon est réparti dans cinq tubes à essai (environ 5 ml chacun) bouchés avec du coton, recouverts de papier kraft et noués avec du fil ou une bande de caoutchouc.

4. Les tubes de bouillon sont stérilisés à 121 ° C (pression de 15 psi) pendant 15 minutes dans un autoclave.

5. On laisse les tubes de bouillon refroidir à la température ambiante.

6. Les bactéries à tester sont inoculées de manière aseptique, de préférence dans une chambre à flux laminaire, dans le bouillon à l'aide d'une boucle d'inoculation stérilisée à la flamme Bunsen. La boucle est stérilisée après chaque inoculation.

7. Les tubes de bouillon inoculés sont incubés à 37 ° C pendant 48 heures dans un incubateur.

8. Le réactif coloré, le para-diméthylaminobenzaldéhyde (p-DMAB) (réactif de Kovac), est versé goutte à goutte dans les tubes de bouillon (0, 5 ml chacun) et observé au bout d'une minute.

Alternativement:

7. Des bandes de papier imbibées d'acide oxalique sont placées à la bouche des tubes de bouillon inoculés, de manière à ce que la moitié environ des bandes de papier reste à l'intérieur des tubes sans toucher le bouillon et l'autre moitié à l'extérieur. Pour cela, le papier filtre est découpé en bandes d'environ 35 mm de long et 5 mm de large. Les bandes sont trempées dans une solution aqueuse saturée chaude d’acide oxalique et séchées avant utilisation.

8. Les tubes de bouillon inoculés sont incubés à 37 ° C pendant 48 heures dans un incubateur.